亮菌多糖的提取及纯化工艺研究

摘要：用乙醇从亮菌液态发酵产物中提取亮菌多糖，采用活性炭吸附色素，乙酸乙酯脱脂，sevage 法除蛋白，反复醇沉等工艺对亮菌多糖进行纯化。使用纤维素柱层析法和纸层析法对纯化后的多糖进行纯度检验，结合红外光谱扫描和测定硫酸基含量两种方法对得到的亮菌多糖进行了简单结构鉴定。结果表明：提取纯化后的亮菌多糖基本没有单糖和寡糖的存在，含量已达到 75%以上，纯度较高，具有羟基、羰基、羟酸基、硫酸酯键等结构，且硫酸基的含量为 98.32μg/g。
亮菌（Armillariella tabescens）属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目口蘑科，假蜜环菌属，是一种能发光的担子菌。亮菌是一种兼有食用和药用价值的名贵食用菌，其主要活性成分为亮菌多糖。多糖是生物体内普遍存在的一大类生物大分子，除有营养作用之外，还具有的生物活性和药理特性。亮菌多糖作为一种低毒而免疫活性强、毒副作用少，来源广的生物大分子，日益受到人们的注意和重视。亮菌多糖是一种性大分子化合物，常用水提醇沉的模式进行分离提取。在前期实验中，尝试通过液体深层发酵工艺培养菌丝体替代固体发酵制备亮菌多糖。本研究主要采用活性炭吸附色素，乙酸乙酯脱脂，sevage 法除蛋白，反复醇沉等工艺对亮菌多糖进行提取纯化。采用纤维素柱对亮菌胞内多糖进行了进一步分离，并通过红外扫描、琼脂糖凝胶电泳、硫酸基含量测定对分离纯化出的亮菌多糖进行结构分析，以期对亮菌多糖理化性质的研究提供理论基础。

1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
菌株：亮菌。
1.1.2 试剂
1.1.2.1 纸层析试剂
展开剂：正丁醇∶吡啶∶水＝6∶4∶3。
显色剂：A：16%硝酸银水溶液∶丙酮＝1∶9。
B：1% NaOH 乙醇溶液（W/V）。
C：6mol/L 氢氧化铵。
1.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳
0.5%琼脂糖溶液。
缓冲液：0.06mol/L 巴比妥缓冲液（pH＝8.6）。
染色剂：0.1%甲苯胺蓝溶液。
洗脱液：醋酸∶乙醇∶水（0.1∶5∶5）。
化学试剂使用分析纯。
1.1.3 培养基
斜面培养基（PDA）：马铃薯 200.0g，葡萄糖 20.0g，琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mL，自然 pH。
液体种子培养基：液体 PDA 培养基。
液体发酵培养基：葡萄糖 50.0g，蛋白陈 4.0g，酵母膏 1.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.1g，维生素 B10.03g，ZnSO40.004g，pH 6.0。
1.1.4 主要设备仪器
5804R 型离心机；RE 52-99型旋转蒸发仪；UV-3802 准双光束紫外可见分光光度计；Spectzwm one 型傅里叶变换红外光谱仪。
1.2 实验方法
1.2.1 亮菌多糖的提取
亮菌进行液体发酵后，收集菌体进行冷冻碾磨，8000r/min 离心 20min，将上清液浓缩至 1/10。添加1/3 体积的 75%的乙醇于上清液中，放置 12h，收集沉淀，离心后于 80℃干燥，得亮菌多糖粉末。
1.2.2 亮菌多糖的纯化
纯化工艺流程：亮菌多糖粉末→活性炭脱色→乙酸乙酯脱脂→savege 法除蛋白→透析去离子→沉淀干燥→纤维素柱层析法分离多糖→纸层析纯度检验
脱色：称取 10g 亮菌多糖粉末，加 250mL 蒸馏水溶解，再加入 0.8g 活性碳，50℃恒温条件下不断搅拌，5h 后 6500r/min 离心 10min，收集上清液。脱脂：在脱色液中加入 5mL 乙酸乙酯，充分混匀后静置 30min，待明显分层后收集水层。
除蛋白：使用 savege 法除蛋白。将 20mL 氯仿∶正丁醇＝4∶1（V∶V）混合溶液加入脱脂后的水溶液中，充分振摇后静置 30min，8000r/min 离心 10min，收集上清液。
去离子：将上清液装入透析袋中，在流动的自来水中透析 48h 后，再用蒸馏水透析 24h。
沉淀干燥：将透析后的溶液加入 1/3 体积的 75%的乙醇，静置 12h 后离心，收集沉淀。用丙酮和乙醚溶液对沉淀进行连续多次洗涤，将得到的亮菌多糖沉淀于 80℃干燥，碾磨后得到白色亮菌多糖粉末。
分离多糖：纤维素层析柱用纤维素填充，柱内纤维素用乙醇预先平衡。将 0.5g 样品加入少量无水乙醇用碾钵研成粉末，搅拌匀后缓缓加入柱中，自然沉降后，调节流速使其上下达到 1mL/min。用600mL 乙醇洗脱液进行连续梯度洗脱，试管收集洗脱液 5mL/每管。用改良的苯酚硫酸法测每管多糖含量，用硫酸钡比浊法测硫酸基含量。
纸层析：用微量注射器吸取一定量样品溶液点在滤纸上，样品点的位置距纸的一端 3cm，样品点彼此间的距离为 2.5cm。样品量 20μg，点样体积在 2-20μL 之间。将点好样的滤纸放入层析缸中上行层析6-8h 后，取出。在层析纸上先喷试剂 A，室温风干，再将纸浸入试剂 B 中，等斑点显出后，再浸入试剂 C中以洗去滤纸上的 Ag2O，然后用水冲洗 1h，风干，还原糖显棕黑色斑点。琼脂糖凝胶电泳：离琼脂糖板下端边缘 1cm 处挖孔，加样量 5μL（约 10μg 多糖）。用微量进样器点样，以葡聚糖作为对照。电压 150V，电泳 1.5h 后，染色并脱色。
1.2.3 多糖含量的测定
采用改良的苯酚-硫酸法。
1.2.3.1 标准曲线的绘制
将 50mL 浓硫酸缓缓加入 10mL 水中，冷却至室温，加入 0.6g 苯酚晶体，搅拌使其溶解配成显色液。称取无水葡萄糖对照品 50.0mg，定容至25mL，得到浓度为 2mg/mL 的对照品溶液。
吸取对照品溶液 1mL，2mL，4mL，6mL，8mL，10mL于 25mL 具塞比色管中，加蒸馏水 3.2mL，然后加入显色剂 6.0mL，迅速摇匀，置沸水浴中加热 30min后，冷水迅速冷却至室温。用水作参比，按分光光度法在 490nm 波长处测定吸光度。
以对照品溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A490）为纵坐标绘制标准曲线。葡萄糖对照品标准曲线见图。求出回归方程为 Y＝1.221x+0.009，相关系数R2＝0.9994，说明建立的回归方程是有意义的。
1.2.3.2 样品中多糖含量的测定
取待测的多糖样品液 1mL，加入显色液 6.0mL，迅速摇匀，然后置沸水浴中加热 30min，冷水迅速冷却至室温，用水做参比，按分光光度法在 490nm 波长处测定吸光度。
1.2.4 硫酸基的测定
采用硫酸钡比浊法。
1.2.4.1 标准曲线的绘制
准确称取 105℃干燥至恒重的的无水 K2SO4108.75mg，定容至 100mL 容量瓶中，摇匀，得到浓度为 600μg/mL 的硫酸盐贮备溶液。
吸取 0mL，0.04mL，0.08mL，0.12mL，0.16mL，0.20mL 标准硫酸盐溶液于具塞试管中，各管以1mol/L HCL 溶液补加总体积至 0.2mL，加入三氯乙酸 3.8mL 及氯化钡－明胶溶液 1.0mL，混合匀，室温静置 15min，用分光光度计在 360nm 处测吸光度A1；以 1.0mL 明胶溶液代替氯化钡溶液，同法测吸光度 A2；以硫酸基含量（μg）为横坐标，吸光度（A1-A2）为纵坐标绘制标准曲线。求出回归方程为 Y＝0.0011x+0.0015，相关系数 R2＝0.9995，说明建立的回归方程是有意义的。
1.2.4.2 样品的测定
称取纯化后的亮菌多糖配制成 1mg/mL 多糖溶液，110℃恒温 3h 后按照标准曲线制作方法操作，再根据标准曲线得硫酸基含量。

2 结果与分析
2.1 亮菌多糖的纯化
亮菌多糖颗粒经脱色脱脂、除蛋白和透析等纯化步骤后，再通过纤维素层析后收集洗脱液，用改良的苯酚硫酸法测每管含量，以管号为横坐标，多糖含量作为纵坐标绘图。分离纯化后的亮菌多糖组分通过纤维素层析柱后分为三个部分，15 管之前为部分，15 到 35 管为第二部分，35 到 55 管为第三部分。、第二部分层析图中出现部分杂峰，可能是由于上柱样品中含有少量寡糖，第三部分可以明显看出两个峰，分析可能是由于得到的亮菌多糖含有两个不同组分所导致。
2.2 纸层析结果
分别将纤维素层析柱所分离出的亮菌多糖的三个部分收集浓缩后，用微量注射器吸取一定量样品溶液进行纸层析。部分的点颜色很淡，第二部分在葡萄糖标准品的位置处出现了较明显的点，可能是由于很少单糖和寡糖的存在，而第三部分在纸层析上没有斑点，说明应该是比较纯的多糖，基本没有单糖和寡糖的存在。通过苯酚硫酸法检测多糖含量已达到 75%以上。
2.3 琼脂糖凝胶电泳结果
根据纸层析结果，第三部分多糖含量较大，且比较纯。将纤维素柱层析后收集的第三部分进行琼脂糖凝胶电泳。可以看到两个明显的斑点，说明亮菌多糖存在两个不同的组分，其结果与纤维素层析法分离结果。
2.4 亮菌多糖的结构分析
2.4.1 亮菌多糖的红外光谱扫描
称取纯化后的亮菌多糖 5mg 用溴化钾压片，置傅里叶变换红外光谱仪 4000-400cm-1中扫描。可以看出，在 3400-3600cm-1处有强烈的 O-H 伸缩振动吸收带；2929cm-1处有强烈的吸收，示有-CH2或 CH3或 C-H 键伸缩振动；1653cm-1和 1548cm-1处有 C=O 和 C-N 伸缩振动吸收带，1420-1320cm-1处有 C-O 伸缩振动和 O-H 弯曲振动偶合产生的两个吸收带；1040cm-1处有强的吸收，示有 C-O-C（糖环）的伸缩振动；1370-1170cm-1处有强烈吸收，示有-O-SO2-R 和-O-SO3-的 S=O 键的对称伸缩和非对称伸缩振动。证明纯化后得到的亮菌多糖具有羟基、羰基、羟酸基、硫酸酯键等结构。
2.4.2 硫酸基含量测定
据文献报道，多糖的抗肿瘤、抗病毒等许多生物活性除与多糖结构、水溶性和分子量的大小等有关外，与其含有的硫酸基团含量(糖基所带硫酸基的个数)等也有着直接的关系。通过测定，亮菌多糖中硫酸基的含量为 98.32μg/g。红外光谱扫描图结果也可以证明硫酸酯键的存在。这为以后研究亮菌多糖的生物活性提供了理论依据。

来源：惠合胶体磨研磨设备厂

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