物理方法提高高温变性豆粕可溶性蛋白质的方法

摘要：研究了微波处理、水浴加热、超声处理及高压均质对高温变性豆粕可溶性蛋白含量的影响。通过实验证明微波处理和水浴加热对提高高温变性豆粕氮溶解指数效果明显，并对两种加热处理方式进行了正交 L9( 34) 优化试验。结果表明，微波( 700 W) 处理在 pH 8. 0，底物质量分数3% ，时间 5 min 时氮溶解指数达到 70. 39% ; 加热处理高温变性豆粕的较佳条件为 pH 8. 0，反应时间 90 min，底物质量分数为 1 %，其溶液氮溶解指数可达 74. 81%; 但在较高底物质量分数( 3%)下，加热处理高温变性豆粕的氮溶解指数只达到 63. 96%。微波处理后蛋白质的其他功能性要优于酶处理后的，因此微波加热处理高温变性豆粕可有效提高生产效率，有利于实现工业化生产。
大豆蛋白是一种优质的植物蛋白质资源，具有良好的功能特性。功能特性的体现要依赖于蛋白质的溶解性，所以，蛋白质的溶解性将影响蛋白质的功能特性。高温变性豆粕是大豆制油后的副产物，制油工艺中高温处理工序造成了蛋白质的热变性，导致了高温变性豆粕的蛋白质溶解度较低。可采用物理、化学、生物方法等的处理方式，以提高蛋白质的溶解性和功能特性，其中物理改性由于较为简单安全，因此被广泛应用。 Jambrak 等利用超声波对大豆蛋白和乳清蛋白进行处理，涂宗财等、Iordache 等对大豆分离蛋白和热变性乳清蛋白进行了高压均质及超高压射频均质处理，结果表明蛋白质的溶解性均有明显提高，并且处理后的蛋白质发泡性、乳化性和凝胶性效果均得到了改善。
Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等在 20世纪 90 年代对大豆分离蛋白进行了不同程度的热处理，热处理后的大豆分离蛋白仍然具有较高的溶解性。近些年随着微波加热技术的发展，利用微波技术辅助加工食品原料成为研究重点。 Tao Yong-zhen 等利用微波加热技术处理多糖类物质，使其溶解性大大提高。但这些技术应用于高温变性脱脂豆粕的文献国内未报道，本研究拟利用超声波、高压均质、水浴加热和微波加热处理方式对高温变性豆粕进行处理，以期提高高温变性豆粕的溶解性。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
高温变性豆粕，黑龙江省双鸭山市杨霖油脂厂。
1. 2 实验仪器及试剂
THZ －82 型恒温水浴振荡器，金坛市亿通电子仪器有限公司;
恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂;
KQ－500B 型容器式超声波仪，昆山市超声仪器有限公司;
MM－2270M 型微波炉，青岛海尔公司;
JJ －0. 1 /60 型均质机，廊坊市通用机械有限公司;
飞鸽TDL －40B 型离心机，上海安亭科学仪器厂;
PHS －3C型酸度计，上海雷磁仪器厂;
HYP －2 型消化炉，上海纤检仪器有限公司;
TDW 马弗炉: 温州市双屿仪器厂。
化学试剂为化学纯或分析纯; 消泡剂为食品级。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 测定方法
蛋白溶解度测定: 蛋白溶解度 = 上清液蛋白质含量/样品总蛋白含量;
蛋白质含量测定参考 GB 5009. 5—2003;
粗脂肪测定参考 GB 5009. 6—2003;
灰分测定参考 GB 5009. 4—2003；水分测定参考 GB 5009. 6—2003;
粗纤维测定参考 GB 5009. 10—2003;
总糖含量测定参考孙伟伟等的检测方法。
1. 3. 2 高温变性豆粕预处理
称取粉碎过 80 目的高温变性豆粕粉 5 g 到 500mL 三角瓶中，加入 250 mL 蒸馏水，在室温下 ( 25℃ ) 振荡摇匀 120 min。
1. 3. 3 超声波处理
将 1. 3. 2 处理好的高温变性豆粕溶液放入超声波器中，分别处理15，30，45，60，75，90，105，120，135min，随后立即放入冰水浴中冷却至室温，在 1 500 r / min下离心 10 min，取上清液用中速滤纸过滤后，测定其蛋白质含量。
1. 3. 4 高压均质处理
将 1. 3. 2 处理好的溶液经过胶体磨两次处理，准备均质处理。调整均质机的均质压力为 5，10，15，20，25 MPa，样品分别经过 1 次和 2 次处理后，冷却、离心等处理方式如 1. 3. 3。
1. 3. 5 微波处理
将1.3.2 处理好的溶液加入适量食用级消泡剂，放入微波炉中在输出频率 140，235，380，520，700 W 下加热处理3 min，冷却、离心等处理方式如1.3.3。
1. 3. 6 水浴加热处理
将 1. 3. 2 处理好的溶液放入 25，40，55，70，85，100 ℃ 水浴中温和搅拌加热处理 120 min 后，冷却、离心等处理方式如 1. 3. 3。
1. 3. 7 微波处理、水浴加热处理的优化设计
以处理时间( min) 、pH、底物质量分数为影响因素，以可溶性蛋白质含量为检测指标进行了L9( 34)正交优化设计。
1. 3. 8 微波处理蛋白质吸油性测定
样品0.5 g 与大豆油3.5 mL 混匀，静置30 min 后，5 000 g 离心 10 min，测定上清液中大豆油的体积。
吸油性( mL/g) = ( 起始大豆油体积－反应后大豆油体积) /样品质量。
1. 3. 9 微波处理蛋白质乳化性测定
40 mL 0. 5% 的样品溶液，加入 14 mL 大豆油，10 000 r·min－ 1的条件下匀浆 1 min 后，立刻取 50μL，加入到 5 mL 的缓冲溶液中( 0. 1 mol /L pH 7. 0PBS) ，混匀，500 nm 下测其吸光值。
乳化性 = ( 2 ×2. 303 × A0× 稀释倍数) /( 10 000 × ? × c) ， ( 1)
式( 1) 中，? 为 0. 25; A0为吸光值; c 为质量浓度( g/mL) 。
1. 3. 10 微波处理后蛋白质凝胶的制备及检测
20% 溶液，均匀搅拌，脱气 10 min，90 ℃ 条件下处理30 min 后，冷却，置冰箱中过夜。通过质构仪测定。
1. 3. 11 酶解高温变性豆粕
1. 4 统计分析
利用 SPSS 13. 0 统计软件进行数据分析检验。
2 结果与讨论
2. 1 大豆高温豆粕成分分析
大豆高温豆粕中水分含量接近 10% ; 蛋白质含量高达 49%( 干基) ，基本接近干基物质总量的一半，含量较高，但氮溶解指数( NST) 仅为 21%。众所周知，这是大豆高温豆粕加热导致蛋白质高级结构发生改变的缘故，加热造成蛋白质肽链松散，大量疏水基团外露，从而使蛋白质 NSI 下降。
2. 2 超声处理对高温变性豆粕 NSI 的影响
在底物质量分数 2%，pH 7. 0 条件下，随处理时间的延长，豆粕溶液的 NSI 值增长显著，当处理时间达到 120 min 时，溶液 NSI 值增长到40. 69% ，随后增长开始趋于平缓( 由 SPSS 的 Dun-can 式分析 120 min 和 135 min 的 NSI 值无显著性差异) 。这可能是超声波的瞬态空化效应，促使能量密度高度聚集，瞬间就会产生高压、高温等一系列极端物理效应，而使蛋白质结构产生崩溃，从而提高蛋白质的溶解性。
2. 3 高压均质对高温变性豆粕可溶性蛋白质影响
随均质压力的不断提高，均质 1 次和2 次的高温变性豆粕溶液的 NSI 值均不断提高，达到 20 MPa 时达到最高，分别为 50. 34% 和 50. 70%，随后开始下降。均质造成的强剪切力是导致高温变性豆粕 NSI 提高的原因，随均质压力进一步增大后，可能使已溶解的蛋白质再次发生结构的改变，疏水性基团暴露，使得 NSI 值下降。
2. 4 加热处理条件对高温变性豆粕 NSI 的影响
温度对高温变性豆粕溶液的 NSI 影响十分显著，随着温度的升高，NSI 值增大，当温度达到 100 ℃时，溶液的 NSI 值到达最高的 66. 56%。这与传统理论认为蛋白质在受热情况下变性，溶解性下降所不同。但本研究的结果与一些研究者的结论是一致的，Arrese 等对大豆分离蛋白的 7S 和11S 蛋白质进行了 DSC 测定，结果发现 7S 和 11S 蛋白质的变性温度分别是74 ℃和83 ℃。 Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等对加热大豆分离蛋白的 NSI 进行了系统研究，发现 100 ℃下大豆分离蛋白仍然具有较高的溶解性。高温加热处理，大豆分离蛋白 NSI 的提高是由于 7S 和 11S 之间的亚基通过二硫键重新结合，疏水性基团被包裹在中间，形成可溶性聚合物，因此加热可以提高高温变性豆粕溶液 NSI 值。
2. 5 微波处理对高温变性豆粕可溶性蛋白质影响
在底物质量分数为 2%，pH 7. 0，微波输出功率对高温变性豆粕溶液的NSI 值影响比较显著，在 520 W、700 W 条件下溶液NSI 值明显高于其他输出功率下的 NSI 值，分别为49. 15% 和 51. 45% ，输出功率在 700 W 条件下 NSI值与 520 W 相比较有显著性差异。由于微波输出功率的不同造成水分子每秒钟的震荡次数不同，输出功率升高，水分子震荡更加激烈，使得溶液温度不断提高，水分子与豆粕的蛋白分子相互碰撞次数升高，从而使蛋白分子的结构造成的一定的变化，使其NSI 值升高。
2. 6 加热处理条件对高温变性豆粕的影响
2. 6. 1 底物质量分数对高温变性豆粕 NSI 的影响
在 100 ℃沸水浴条件下，随底物质量分数从 1% ～2%，高温变性豆粕溶液的NSI 值基本没有变化 ( 仅从 68. 81% 缓慢下降到68. 53% ) ，当底物质量分数继续增高，NSI 值急剧下降。这可能由于沸水浴向底物传递的热量是一定的，当溶液浓度过大时，加热所提供的热量不足以使高温变性豆粕全部的 7S 和 11S 蛋白质之间的亚基重新结合，形成可溶性聚集物，因此当底物浓度增高，相对于全部蛋白质的可溶性蛋白质，由于没有形成足够的可溶性聚合物，造成其 NSI 值下降。
2. 6. 2 时间对高温变性豆粕可溶性蛋白质的影响
随着时间增加，高温变性豆粕溶液的 NSI 值逐渐增高。统计分析表明: 时间达到60 min 时溶液 NSI 值为 67. 21% ，与更长时间的 NSI值无显著性差异( 由 SPSS 的 Duncan 式分析 60 min后的 NSI 值无显著性差异) ，因此认为从 60 min 后溶液 NSI 值趋于平缓。
2. 6. 3 pH 值对高温变性豆粕可溶性蛋白质的影响
pH 值对热处理高温变性豆粕溶液的 NSI 值影响的趋势明显，随溶液 pH 升高，溶液的 NSI 值不断增加，当 pH 7. 0 时达到62. 63%，之后趋于平缓，这是由于在较高 pH 值下，被质子化的酸性及碱性氨基酸残基基团失去了质子，使得蛋白质带负电; 另外，pH 值会改变蛋白质的高级结构，不同结构下的氨基酸残基不同，从而导致蛋白质溶解性的改变。
2. 6. 4 加热处理高温变性豆粕的条件优化
依据加热处理高温变性豆粕的单因素实验结果，选取对提高 NSI 显著的因素和水平，设计正交试验。极差分析发现，pH 值对高温变性豆粕溶液的NSI 值影响最为显著，其次为加热时间和底物浓度。
优化方案为: A3B3C1，即 pH 8. 0，时间 90 min，底物质量分数 1%。经过验证，在此条件下高温变性豆粕溶液的NSI 值高达为 74. 81% 。
2. 7 不同微波处理条件对高温变性豆粕 NSI 影响
2. 7. 1 微波处理时间对高温变性豆粕 NSI 的影响
随微波加热处理时间的增长，高温变性豆粕溶液的 NSI 值不断增长，到达 4 min时为 69. 1%，随后开始趋于平缓。
2. 7. 2 底物质量分数对高温变性豆粕可溶性蛋白质的影响
随底物浓度增加，高温变性豆粕溶液 NSI 值不断升高，当底物质量分数达到 4%时，NSI 值达到 70. 83% 为最高，随即开始下降。这与加热处理有所不同，由于微波加热的分子运动的高能量，使得溶液加热更充分，但底物质量分数过高，可能使高温变性豆粕蛋白受热不充分，从而导致溶液 NSI 值下降。
2. 7. 3 pH 值对高温变性豆粕可溶性蛋白质的影响
随溶液 pH 值升高，高温变性豆粕溶液 NSI 值先升高，pH 值达到 7. 0 时 NSI值为 71. 49 %，随后趋于平缓。这与加热处理的 pH值影响趋势基本相同。
2. 7. 4 微波加热处理高温变性豆粕的条件优化
根据微波处理高温变性豆粕的单因素实验结果，确定对 NSI 影响显著的因素和水平，设计正交试验。极差分析发现，以因素 pH 值对高温变性豆粕溶液的 NSI 值影响最为显著，然后依次为时间和底物质量分数，优化方案为: A3B3C1，即 pH 8. 0，时间5min，底物质量分数 3% 。
通过验证实验证明，在此条件下高温变性豆粕溶液的 NSI 值高达 70. 39%。
2. 8 吸油性的研究
大豆分离蛋白( SPI) 、未处理高温变性豆粕( control) 、微波改性后的高温变性豆粕( MWIT) 、酶解改性后的高温变性豆粕( EMT) 吸油性差异比较结果比较。MWIT、EMT 以及 SPI、对照样品吸油性差异性显著。与对照样品相比，SPI的吸油性最高，MWIT 其次，EMT 最低。形成这种结果的原因可能是微波改性改变了蛋白质结构，使原本变性的蛋白质结构进行了重排，趋向于恢复 SPI的功能性，使疏水集团大量暴露，提高吸油性。酶改性蛋白质分子量下降，亲水基团数量上升而疏水基团数量下降，导致其亲油性下降。
2. 9 pH 值对样品乳化性的影响
随 pH 值的升高，样品的乳化性整体呈上升趋势; 但在 pH 值为 4. 0 时，4 种样品的乳化性均最低。
SPI、control、MWIT 以及 EMT 的乳化性分别从 1. 58，1. 42，2. 87，1. 20 mL / g 上升到 26. 41，17. 29，27. 83，8. 47 mL / g。由此可知，微波改性明显提高了高温变性豆粕的乳化性，显著高于酶改性样品。这可能是微波处理后的蛋白质形成了聚合物，亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基分布均匀，当遇到水和油时能够更好地将亲水基和疏水基在两相界面展开，pH 值升高有利于聚合物在油和水界面的分布，并形成均一稳定的乳化液。而酶改性蛋白质由于酶解过程，蛋白质分子量变小，大量疏水性氨基酸被酶解，在两相界面不能形象良好的伸展，致使其亲油性下降。而酶改性使得蛋白质分子质量亲水性氨基酸残基大量暴露而疏水性氨基酸残基被大量破坏，使得乳化性明显下降。
2. 10 样品凝胶性的研究
SPI 和 MWIT 形成了较为结实的凝胶，凝胶强度超过了 300 g，而且 MWIT 形成的凝胶强度和黏度都比 SPI 大; 样品 control 和 EMT 未检测到凝胶的形成，这可能是 control 样品在加热中的热变性破坏了其三、四级结构，从而丧失了形成凝胶的能力。由于微波处理形成的聚合物，以二硫键为主形成更为稳定的凝胶网状结构，有利于水分的保持，产生更大的凝胶强度。
2. 11 加热处理和微波处理对高温变性豆粕 NSI影响的比较
微波处理靠电子辐射，造成分子震动，并使溶液温度升高; 加热处理靠热传递对溶液升温。这两种方式都是由于加热使大豆球蛋白的 AB 亚基断裂，与 β-半球蛋白的亚基发生结合，形成新的可溶性聚合物，使高温变性豆粕的 NSI 值升高。在相同底物质量分数( 3%) 下，微波处理后 NSI 值达到 70. 39%，但加热处理后 NSI 值仅为 63. 96%。从得到的结果分析，加热处理和微波处理对提高高温变性豆粕的 NSI 值都十分有效，尤其是微波处理的底物浓度更高，处理的时间更少，处理的效果更显著，因此，微波处理技术应用在高温变性豆粕溶解性改性方面具有良好的工业化生产前景。
微波处理后的 NSI 值低于本课题组酶解处理后的 NSI 值，但微波改性后蛋白质的吸油性、乳化性和凝胶性均优于酶解处理后的。这是由于蛋白质具备高级结构时才具备蛋白质的功能特性，微波处理使得蛋白质形成了可溶性聚合物，分子质量提高，而酶解使蛋白质分子质量减小，肽链断裂，疏水性氨基酸残基数量减少，更多的亲水性氨基酸残基暴露，溶解性上升，但蛋白质高级结构被破坏，功能性下降。
来源：惠合胶体磨设备厂